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技术支持

Ugo Basile | 经典冷热刺激实验——啮齿类动物热痛觉及相关行为学研究的全面解决方案!

时间:2024-01-22来源:本站作者:玉研仪器

一.疼痛及热痛觉实验

国际疼痛研究协会(The International Association for the Study of Pain,IASP)给出定义,疼痛指一种实际或潜在与组织损伤相关的,或类似的不愉快的感觉和情感体验。来自《柳叶刀》的一篇研究综述指出,全球有30%的人群遭受慢性疼痛的折磨。《中国疼痛医学发展报告(2020)》数据显示,我国慢性疼痛患者超过3亿人。疼痛已成为继心脑血管疾病、肿瘤之后的第三大健康问题,对人类的身心健康造成巨大危害。因此,疼痛的产生原因、发生机制和镇痛药物等研究引起了科研人员的极大兴趣。




根据疼痛的发生机制,疼痛可分为伤害性疼痛、神经性疼痛等。由于疼痛具有很强的主观性,临床开展大规模疼痛研究在评价标准统一化方面存在着一定局限性,直接进行人体实验也会带来许多伦理问题。啮齿类动物作为最常见的实验动物,与人类的基因同源性高,还具有饲养方便、易于繁殖、造模周期短、稳定性强等优点。针对啮齿类动物的诱发性疼痛测试是目前疼痛研究领域最常见的动物实验。疼痛的诱发方式主要分为机械刺激和冷热刺激,其中热痛觉实验主要有冷热板实验(Hot/Cold plate test)、足底热点实验(Hargreaves test)、甩尾测试(Tail-flick test)及温度偏好测试等。


二.Ugo Basile简介

Ugo Basile公司于1963年在意大利米兰创立,公司创始人Ugo Basile先生曾是米兰大学兽医生理学系的首席实验技术员。他在开发和改良动物实验仪器方面拥有丰富的经验,成功推出多种广受好评的先进仪器。经过数十年的发展和不断的技术革新,Ugo Basile已经成长为一家专注神经科学领域实验方法、实验仪器开发的创新型公司。公司旗下疼痛类产品作为全球科研工作者所信赖的科研工具,得到了数万篇文献引用。本文将为您介绍数种Ugo Basile公司的经典热痛觉研究设备和典型应用场景。



三.冷热板测试仪

热板法作为啮齿动物热痛觉评估的“金标准”,自上世纪中叶诞生以来广受推崇。热板法对动物组织损伤小,操作简便,可重复实验,痛觉反应潜伏期长,可以体现出不同实验条件间的细微差别。动物在热刺激下做出抬足、舔足、跳跃等行为的潜伏期(s)作为热痛觉敏感度的主要评价指标,从而区分痛觉过敏和异常性疼痛的差异。



Ugo Basile冷热板专为啮齿类动物冷热痛觉测试设计,具有-5℃-65℃的温度调节范围,满足冷、热痛觉实验需求;多阶段温度设定支持升温热板法,适合筛选非强效镇痛药物。仪器标配的数字键盘可将数字0-9定义为十种不同的动物反应(如抬足、舔舐、抓挠、跳跃、梳理等),同时考察记录多种实验现象,将痛觉与行为学研究相关联。冷热痛测试实验结果准确反映痛觉过敏、痛觉超敏等现象,主要应用于疼痛机制研究和镇痛药物筛选。


典型使用场景:


有证据表明,骨关节炎与一些患者的高胆固醇水平有关。为了进一步研究胆固醇对体内骨关节炎(OA)发展的影响,Cao等人考察了高胆固醇饮食 (HCD) 对前十字韧带横切术(ACLT) 诱导OA小鼠的影响。经HCD 处理的小鼠体重、血清总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL)水平均有所增加。作者使用Ugo冷热板评估不同实验组小鼠的热痛觉反应阈值并同时记录数种伤害性反应的出现时间。实验结果表明HCD 显著增加了 ACLT引起的术后疼痛。

[1] Al-Arfaj A S. Radiographic osteoarthritis and serum cholesterol[J]. Saudi medical journal, 2003, 24(7): 745-747.
[2] Cao C, Shi Y, Zhang X, et al. Cholesterol-induced LRP3 downregulation promotes cartilage degeneration in osteoarthritis by targeting Syndecan-4.


四.红外足底热点仪

Hargreaves测试法专门为评估大鼠和小鼠等啮齿动物的热痛觉而设计,是一种检测痛觉过敏和镇痛反应的灵敏方法。由聚焦光源产生的热刺激间接加到动物后爪足底表面,动物缩足反应的潜伏期(Paw Withdraw Latency,PWL)被记录并作为评价指标。Hargreaves实验中动物处于无约束自由状态,可以进行双侧测试,实验过程全自动化。通过配套的测试平台还能轻松对动物痛觉过敏后的行为进行研究。该测试已用于神经损伤/再生后疼痛过敏或热痛反应恢复等实验,药理学家成功地利用这一测试来揭示镇痛药物的作用,并预测药物对人类的镇痛效果。



Ugo Basile红外足底热点仪基于Hargreaves法,专为大小鼠热痛觉评估设计,是测量大小鼠足底热痛觉过敏的最佳设备。仪器测量并自动记录热刺激下缩足反应的潜伏期(PWL)。采用红外光源可以避免可见光对动物的影响,刺激强度0-100%可调,满足不同实验需求。同时,选配大鼠面部刺激固定器还可进行大鼠下颌部三叉神经热痛觉测试。Ugo Basile足底热点仪已被评为Hargreaves测试的推荐设备(Bio-protocol,2017),共发表2000多篇SCI文章。


典型使用场景:



关节软骨的修复和再生在临床上尚未得到满足,因为组织的自我再生能力很差。Jin等人发现前列腺素E受体4(PTGER4或EP4)在人和小鼠关节软骨损伤后的表达均显著增加,并通过实验证实EP4在骨关节损伤中起关键作用。相对于假手术组,微骨折(MF)手术后EP4f/f组小鼠PWL显著降低;而由于特异性的EP4基因缺失,EP4Col2小鼠MF术后PWL比EP4f/f小鼠有显著提高(图1.2.1-7)。实验结果表明敲除EP4可以减轻关节疼痛。Ugo Basile红外足底热点仪在本工作中体现了实验过程全自动化和高通量测试等优势,在短时间内可完成数组小鼠的测试。

[1] Jin Y, Liu Q, Chen P, et al. A novel prostaglandin E receptor 4 (EP4) small molecule antagonist induces articular cartilage regeneration[J]. Cell Discovery, 2022, 8(1): 24.


五.甩尾测试仪

Amour和Donn L. Smith希望为镇痛药物筛选开发一种全新、稳定、可重复性好的动物用测痛方法:将大鼠的尾部放置于光源上方,光聚焦于尾部并产生热量,动物感受到疼痛后会抽动尾部,这是一种脊髓的屈曲反射。令人吃惊的是,在对几百只大鼠进行上万次测试后,他们发现这种甩尾现象个体变异极小,高度可重复,且不受环境条件影响。这种方法可以对轻度麻醉动物进行测试,对动物的运动协调功能无要求,多用于中枢性镇痛药物的筛选。动物发生甩尾反应所需时间(Tail-Fick Latency,TFL)可代表疼痛阈值。



Ugo Basile甩尾测试仪可准确测量大小鼠尾部对红外热刺激的伤害感受敏感性。记录动物对红外热辐射痛的反应时间,可用于快速筛选镇痛药物。仪器结合了热刺激和点刺激的优势,不产生交互行为,动物应激小,测试结果可重复性极高。


典型使用场景:



Pieretti等人使用卡拉胶降低小鼠痛觉阈值从而研究木通苯乙醇苷A(木通科植物中提取的一种天然产物)潜在的抗痛觉作用。如图所示,在给药后3和4小时,50和100 μg的木通苯乙醇苷A能够显著减轻卡拉胶诱导的热痛觉过敏。作者首次强调了这种天然衍生化合物的潜在和选择性抗炎特性,促使其用于进一步研究。作者团队使用Ugo Basile甩尾测试仪进行尾闪实验的总测试时间短,获得的实验结果均一性好。

[1] D'Amour F E, Smith D L. A method for determining loss of pain sensation[J]. J Pharmacol Exp Ther, 1941, 72(1): 74-9.
[2] Pieretti S, Saviano A, Mollica A, et al. Calceolarioside A, a phenylpropanoid glycoside from Calceolaria spp., displays antinociceptive and anti-inflammatory properties[J]. Molecules, 2022, 27(7): 2183.


六.热偏好测试仪

温度感知、温度调节行为是生物进化过程中重要的感觉能力。近年来,温度传感器和热调节机制成为更多科研人员的研究主题,在温度相关领域研究中,热偏好表型可用于神经性疼痛研究、周围神经病变、温度敏感性评估、药物筛选等。传统的热偏好实验将动物放置在两个冷热板拼接的区域中,动物可在两种温度环境间做出选择。但这种实验效率低下,仅有两种温度也不能真正反映复杂的机体生理情况。

Ugo Basile热偏好测试仪基于Zimmermann教授团队的研究:新型环状热偏好设备可使动物在一个环形区域内活动,避免了小鼠偏好呆在角落里的刻板行为造成的实验误差。圆环内的温度是梯度分布的(两个半圆各12个区域),可设置温度在4℃至65℃渐变,减少了对动物的刺激。仪器通过视频跟踪获得动物活动数据,红外可透射的环形内壁提高了图像捕捉的精准度。通过搭配Any-Maze行为学分析软件可实现自动分析区域停留时间、区域进入次数、偏好温度、温度偏好热图、总移动距离、移动速度、加速度等参数。


本仪器广泛用于研究小鼠的热偏好表型,温度感知和体温调节相关的细胞和分子机制、伤害感受器、温度感知受体、冷热异常性疼痛和超敏反应的基础机制研究以及镇痛药物的筛选。


典型使用场景:



Lei等人研究了TMEM79蛋白质对TRPV离子通道(可被温度激活)的影响,研究表明TMEM79可以降低TRPV3介导的电流,但对TRPV4介导电流无影响。随后的免疫染色实验结果证明TMEM79下调TRPV3质膜蛋白水平,从溶酶体标记实验结果推测TMEM79在内质网中捕获TRPV3,与TRPV3形成复合物并导致TRPV3在溶酶体中降解。他们还对不同的基因缺陷小鼠进行了热偏好实验,统计分析小鼠在不同温度区域的停留时间,进一步证实推论。Ugo Basile热偏好测试仪在本工作中体现出多温度梯度,精准控温,自动分析实验数据的优点。

[1] Lei J, Yoshimoto R U, Matsui T, et al. Involvement of skin TRPV3 in temperature detection regulated by TMEM79 in mice[J]. Nature communications, 2023, 14(1): 4104.


七.Ugo Basile热痛产品使用场景总结


八.拓展阅读

[1] Cohen S P, Vase L, Hooten W M. Chronic pain: an update on burden, best practices, and new advances[J]. The Lancet, 2021, 397(10289): 2082-2097.
[2] Orthofer, Michael, et al. "Identification of ALK in Thinness." Cell 181.6 (2020): 1246-1262.doi: 10.1016/j.cell.2020.04.034
[3] Cetin, Zeynep, et al. "The Role of Hydrogen Sulfide in the Development of Tolerance and Dependence to Morphine in Mice." Neuropsychobiology 80.3 (2021): 264-270.
[4] Ford, Neil C., et al. "Role of primary sensory neurone cannabinoid type-1 receptors in pain and the analgesic effects of the peripherally acting agonist CB-13 in mice." British journal of anaesthesia 128.1 (2022): 159-173.
[5] La Montanara, Paolo, et al. "Cyclin-dependent–like kinase 5 is required for pain signaling in human sensory neurons and mouse models." Science translational medicine 12.551 (2020): eaax4846.
[6] Feng, Jiao, et al. "A new painkiller nanomedicine to bypass the blood-brain barrier and the use of morphine." Science advances 5.2 (2019): eaau5148.
[7] Schumacher G A, Goodell H, Hardy J D, et al. Uniformity of the pain threshold in man[J]. Science, 1940, 92(2379): 110-112.
[8] Huang F, Chen X, Jiang X, et al. Betaine ameliorates prenatal valproic‐acid‐induced autism‐like behavioral abnormalities in mice by promoting homocysteine metabolism[J]. Psychiatry and Clinical Neurosciences, 2019, 73(6): 317-322.
[9] Kocevski D, Tvrdeić A. The effect of repeated daily measurements on paw withdrawal latencies in Hargreaves test[J]. Collegium antropologicum, 2008, 32(1): 93-97.

[10] Zhou L, Kong G, Palmisano I, et al. Reversible CD8 T cell–neuron cross-talk causes aging-dependent neuronal regenerative decline[J]. Science, 2022, 376(6594): eabd5926.



九.Ugo Basile与玉研仪器

上海玉研科学仪器公司作为多家国际知名生命科学实验设备公司在国内的金牌合作伙伴,也与Ugo Basile建立了紧密合作。长期以来,玉研仪器深度参与Ugo品牌在国内市场的发展规划并达成了多项战略协议。自2024年1月1日起,我司获得厂家独家授权,将全面负责Ugo Basile热偏好测试仪(Thermal Gradient Ring,SKU 35550)、口面部疼痛测试仪(Orofacial Stimulation Test)在大陆内地及香港的销售、市场推广和技术支持等工作。更多详情请咨询我司销售人员或直接联系021-35183767。







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